दिल्ली स्थित नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ प्लांट जीनोम रिसर्च (NIPGR) के वैज्ञानिकों ने फॉस्फेट अपटेक और ट्रांसपोर्ट को बढ़ाने के लिए CRISPR-CAS9 जीन एडिटिंग तकनीक का उपयोग किया है। बिही चावल की किस्में। परिणामस्वरूप चावल की रेखाओं में उच्च बीज और पैनिकल संख्या होती थी, जिससे बीज की गुणवत्ता से समझौता किए बिना उपज बढ़ जाती थी। अध्ययन एक ग्रीनहाउस में किया गया था।
पौधों के विकास और पौधों के विकास के लिए फॉस्फोरस एक आवश्यक खनिज है। सीमित फास्फोरस की उपलब्धता के मामले में, फसल उत्पादकता में काफी गिरावट आती है। यहां तक कि जब फॉस्फेट उर्वरकों का उपयोग किया जाता है, तो केवल 15-20% को पौधों द्वारा लिया जाता है, जबकि शेष राशि को अपवाह के माध्यम से बाहर निकाल दिया जाता है या खो जाता है।
जब फॉस्फेट उर्वरक की अनुशंसित मात्रा का उपयोग किया गया था, तो जीन संपादित चावल लाइनों में उपज में 20% की वृद्धि हुई। हालांकि, जब फॉस्फेट उर्वरक की अनुशंसित खुराक का केवल 10% उपयोग किया गया था, तो जीन-संपादित चावल लाइनों में उपज ने नियंत्रण की तुलना में 40% की वृद्धि की, NIPGR से डॉ। जितेंडर गिरी कहते हैं, और एक पेपर के संगत लेखक में प्रकाशित किया गया है। संयंत्र जैव प्रौद्योगिकी पत्रिका।
“उद्देश्य केवल यह प्रदर्शित करना था कि अनुशंसित खुराक के केवल 10% का उपयोग करने की चरम परिस्थितियों में भी, जीन-संपादित लाइनों ने फॉस्फेट में वृद्धि को दिखाया, जिसके परिणामस्वरूप नियंत्रण समूह की तुलना में 40% अधिक उपज हुई, जहां उपज में तेजी से कमी आई,” डॉ। गिरी कहते हैं। “लेकिन अगर फॉस्फेट उर्वरक की आपूर्ति 10% या 30% तक कम हो जाती है, तो यह बहुत संभावना है कि जीन-संपादित लाइनें अभी भी नियंत्रण संयंत्रों से बेहतर प्रदर्शन करेंगी।”
चावल अपनी जड़ों के माध्यम से फॉस्फेट को अवशोषित करता है और इसे शूट में स्थानांतरित करता है। ट्रांसपोर्टरों का एक वर्ग मिट्टी से फॉस्फेट को जड़ में लाता है, जबकि एक और अकार्बनिक फॉस्फेट ट्रांसपोर्टर (OSPHO1; 2) फॉस्फेट को जड़ से शूट करने के लिए स्थानांतरित करता है। NIPGR शोधकर्ताओं ने अपने काम को फॉस्फेट ट्रांसपोर्टर तक सीमित कर दिया जो फॉस्फेट को जड़ से शूट करने के लिए स्थानांतरित करता है। “जब फॉस्फेट ट्रांसपोर्टर ओस्फो 1; 2 अधिक काम करना शुरू कर देता है, तो यह जड़ में फॉस्फेट की अधिक मांग पैदा करेगा। जब ऐसा होता है, तो रूट-बाउंड ट्रांसपोर्टर्स मिट्टी से अधिक फॉस्फेट को जड़ में लाएंगे,” वे बताते हैं। “हम पहले से ही जानते हैं कि एक नकारात्मक नियामक है जो मॉडल प्लांट में फॉस्फेट ट्रांसपोर्टर की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है अरबिडोप्सिस। लेकिन चावल में जो कुछ भी हो रहा है वह अब तक ज्ञात नहीं था। ”
पहचान, दमनकारी को हटाना
के माध्यम से सिलिको में और डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन अध्ययन, निप्र शोधकर्ताओं ने दमनर (ओसॉवर्की 6) की पहचान की और प्रदर्शित किया कि दमनकारी शारीरिक रूप से प्रमोटर को बांधता है। यह सत्यापित करने के लिए कि क्या रिप्रेसर वास्तव में फॉस्फेट ट्रांसपोर्टर की अभिव्यक्ति को कम कर रहा था, उन्होंने CRISPR-CAS9 जीन एडिटिंग टूल का उपयोग करके इसे बाहर खटखटाते हुए दमनकर्ता को चुप कराया। जब दमनकारी को खटखटाया गया, तो फॉस्फेट ट्रांसपोर्टर (OSPHO1; 2) की अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि हुई।
ट्रांसपोर्टर की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति को आदर्श रूप से अधिक उपज का नेतृत्व करना चाहिए। लेकिन इसके बजाय, जीन-संपादित चावल लाइनें नियंत्रण की तुलना में खराब तरीके से हुईं। “यह अप्रत्याशित था। हमें पता चला कि दमनकर्ता को संयंत्र में अन्य कार्यों के लिए भी आवश्यक था। जबकि रिप्रेसर जीन को खटखटाने से पूरी तरह से फॉस्फेट ट्रांसपोर्टर के दमन को हटाने में मदद मिली, जिससे शूटिंग में फॉस्फेट के स्तर में वृद्धि हुई, हम भी दमनकर्ता द्वारा विनियमित कुछ आवश्यक कार्यों को हटा रहे थे।”
बाध्यकारी साइट को हटाना
शोधकर्ताओं ने तब उस साइट की पहचान की जहां दमनकर्ता वास्तव में प्रमोटर को बांधता है। प्रमोटर में बाध्यकारी साइट सिर्फ 30 बेस जोड़े का एक बहुत छोटा अनुक्रम है। फिर से CRISPR-CAS9 का उपयोग प्रमोटर पर रिप्रेसर के बाध्यकारी पक्ष को हटाने के लिए किया गया था। “हमने केवल बाध्यकारी साइट को हटा दिया है और न कि दमनकर्ता ही है। इसलिए दमनकारी संयंत्र में मौजूद है और अन्य महत्वपूर्ण पौधों के कार्यों को निष्पादित करना जारी रखता है,” डॉ। गिरी बताते हैं।
फॉस्फेट ट्रांसपोर्टर (OSPHO1; 2) को अन्य नियामकों द्वारा भी विनियमित किया जाता है। विशेष रूप से केवल उस साइट को हटाकर जहां रेप्रेसर प्रमोटर को बांधता है, शोधकर्ताओं ने सुनिश्चित किया कि अन्य नियामकों के बाध्यकारी साइटें बरकरार हैं ताकि वे प्रमोटर को बांधना जारी रख सकें और इसके कार्य को विनियमित कर सकें। डॉ। गिरी ने इसे प्रमोटर जीन में एक बहुत ही सटीक, न्यूनतम आक्रामक सर्जरी करने के लिए पसंद किया है।
जड़ों में प्रमोटर की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति थी, साथ ही शूट फॉस्फेट संचय और बेहतर पौधे की वृद्धि के साथ जीन-संपादित चावल के पौधों को रूट से फॉस्फेट के स्थानांतरण के लिए बढ़ते हुए, जब फॉस्फेट जीन की बाध्यकारी साइट को फॉस्फेट प्रमोटर से हटा दिया गया था।
हालांकि शूट में पाए गए प्रमोटर में केवल बाध्यकारी साइट जीन-संपादित थी, शोधकर्ताओं ने पाया कि जड़ की सतह में मौजूद अन्य ट्रांसपोर्टरों ने रूट में अधिक फास्फोरस लाया। “जड़ें मिट्टी से अधिक फॉस्फेट को अवशोषित करके एक सिंक की तरह व्यवहार करना शुरू कर देती हैं, और यह फॉस्फेट पूरे पौधे में वितरित किया जाता है,” वे कहते हैं। टीम ने पाया कि जीन-संपादित लाइनें जड़ों द्वारा अवशोषित अतिरिक्त फॉस्फेट को चैनल कर रही थीं, जो पैनल्स की संख्या को बढ़ाकर अधिक बीज का उत्पादन करने के लिए-फलने वाले शरीर जो बीजों को सहन करते हैं-20%की उपज में वृद्धि के लिए अग्रणी। शोधकर्ताओं ने बीज के आकार, बीज आयाम, बीज की लंबाई, स्टार्च और फॉस्फेट सामग्री का विश्लेषण किया, और बीज आयाम या बीज की गुणवत्ता को सामान्य पाया।
चूंकि जीन-संपादित पौधों की जड़ें पहले की तुलना में अधिक फॉस्फेट को अवशोषित करती हैं, तो क्या फॉस्फेट उर्वरक की समान मात्रा का उपयोग करना जारी रखना और भी अधिक आवश्यक हो जाएगा? लागू किए गए फॉस्फेट उर्वरक का केवल 20% केवल पौधों द्वारा लिया जाता है क्योंकि डॉ। गिरी का कहना है कि फॉस्फेट बहुत प्रतिक्रियाशील है। क्षारीय मिट्टी में, फॉस्फेट कैल्शियम या मैग्नीशियम के साथ परिसर बनाता है, और यदि यह अम्लीय है, तो यह लोहे और एल्यूमीनियम के साथ जटिल बनाता है। चूंकि फॉस्फेट कॉम्प्लेक्स प्रकृति में अघुलनशील होते हैं, इसलिए रूट में पाए जाने वाले ट्रांसपोर्टर्स उन्हें अवशोषित नहीं कर सकते हैं। “जीन-संपादित चावल के मामले में, पौधे जल्दी से अधिक फॉस्फेट को अवशोषित कर लेंगे, इससे पहले कि यह एल्यूमीनियम, लोहे, कैल्शियम या मैग्नीशियम के साथ संयोजित होता है और अघुलनशील हो जाता है,” वे बताते हैं।
जपोनिका का उपयोग करके परिकल्पना का परीक्षण
अध्ययन के लिए, बिही जीन-संपादित लाइनें और ट्रांसजेनिक्स बनाने के बाद से कल्टीवेटर निप्पोनबारे का उपयोग किया गया था बिही। “बिही विविधता के साथ काम करना आसान है; ट्रांसजेनिक्स का उपयोग करना आसान नहीं है इंडिका किस्में। भारतीय खेती का उपयोग करते समय पर्याप्त संख्या में जीन पौधों को उत्पन्न करने में अधिक समय लगेगा, “डॉ। गिरी कहते हैं।” तो, हम अपनी परिकल्पना का परीक्षण करते हैं बिही विविधता क्योंकि यह जल्दी और अधिक मज़बूती से किया जा सकता है, और फिर इसे भारतीय में दोहराएं इंडिका किस्में। ”
नेशनल सेंटर फॉर बायोलॉजिकल साइंसेज (एनसीबीएस), बेंगलुरु में एपिजेनेटिक्स लैब के डॉ। पीवी शिवप्रासाद कहते हैं, “यह एक बहुत ही महत्वपूर्ण वैज्ञानिक उन्नति है, जो बेंगलुरु, जो अध्ययन का हिस्सा नहीं है। “भारत के कई हिस्सों में मिट्टी में फास्फोरस की कमी है। जब समान संशोधन किए जाते हैं इंडिका चावल की रेखाएं, यह बेहद उपयोगी होगी। एक को फॉस्फेट अवशोषण की प्रभावकारिता की भी जांच करनी चाहिए, और फॉस्फेट उर्वरक का उपयोग बिना उपज से समझौता किए बिना कितना कम किया जा सकता है इंडिका लाइनें। रोमांचक समय आगे। ”
बंद लक्ष्य की घटनाएं
कार्यकर्ताओं ने इस आधार पर जीन-संपादित प्रौद्योगिकी पर आपत्तियां उठाई हैं कि आईपीआर विदेशी संस्थाओं द्वारा आयोजित की जाती है। डॉ। गिरी का कहना है कि भारत CRISPR-CAS9 तकनीक के लाइसेंस के लिए बातचीत कर रहा है। CRISPR-CAS9 जीन एडिटिंग तकनीक हमेशा केवल आधार/रुचि के जीन को लक्षित नहीं करती है। ऑफ-टारगेट इवेंट होते हैं, जो कार्यकर्ताओं द्वारा उठाए गए एक और आपत्ति है।
ऑफ-टारगेट घटनाओं की समस्या को संबोधित करने के लिए, डॉ। गिरी का कहना है कि ऐसे सॉफ्टवेयर हैं जो भविष्यवाणी करते हैं कि एक इच्छित जीन संपादन कहां अप्रत्याशित, अवांछित, या यहां तक कि जीनोम में प्रतिकूल परिवर्तन का कारण हो सकता है। डॉ। गिरी कहते हैं, “हमने सभी ऑफ-टारगेट जीनों के लिए जाँच की कि क्या कोई बदलाव हैं। हमारे मामले में, हमने शीर्ष 10 दावेदार ऑफ-टारगेट साइटों का परीक्षण किया और उन साइटों पर कोई विलोपन नहीं मिला,” डॉ। गिरी कहते हैं। इससे पहले कि बीजों को वास्तव में अनुमोदित और जारी किया जाए, और किसानों को खेती करने की अनुमति दी जाती है, यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयास किए जाएंगे कि विलोपन केवल प्रवर्तक पर रिसेप्टर बाइंडिंग साइट पर प्रतिबंधित है, जिसमें कोई ऑफ-टारगेट प्रभाव वास्तव में देखा गया है, वे कहते हैं। “हम वास्तव में क्या करते हैं कि हम बड़ी संख्या में लाइनों का उत्पादन करते हैं और फिर सबसे अच्छी लाइन का चयन करते हैं और ऑफ-टारगेट्स के लिए जांच करते हैं,” डॉ। गिरी कहते हैं।
डॉ। शिवप्रसाद कहते हैं, “ऑफ-टारगेट इवेंट्स को खत्म करना बहुत संभव है।” “गाइड आरएनए डिज़ाइन के लिए कई उपकरण उपलब्ध हैं जो ऑफ-टारगेट इवेंट की संभावना को लगभग समाप्त कर देते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए ऑफ-टारगेट क्षेत्रों की जांच करना भी महत्वपूर्ण है कि ऑफ-टारगेट इवेंट नहीं हुए हैं। इसे विशेषज्ञता की आवश्यकता है।”
डॉ। शिवप्रसाद के अनुसार, तीन से अधिक अच्छे हैं सिलिको में ऑफ-टारगेट इवेंट की जांच करने के लिए उपलब्ध उपकरण। “दक्षिणी धब्बा विश्लेषण, विशेष रूप से जंक्शन टुकड़ा विश्लेषण, एक जीनोम के भीतर डीएनए अनुक्रमों के सफल एकीकरण या संशोधन को सत्यापित करने और यह पुष्टि करने के लिए किया जाता है कि क्या कई प्रतियां या आधी प्रतियां मौजूद नहीं हैं,” वे कहते हैं।
NIPGR शोधकर्ताओं ने ऊतक संस्कृति-आधारित ट्रांसजेनिक पीढ़ी का उपयोग किया है। जब पौधों को ऊतक संस्कृति का उपयोग करके उत्पादित किया जाता है, तो बीज का उत्पादन करने से पहले ही पौधों को जांचने के लिए परीक्षण किया जाता है कि क्या जीन संपादन किसी भी ऑफ-टारगेट घटनाओं के बिना सटीक हो गया है। “केवल अगर जीन एडिटिंग बिना किसी ऑफ-टारगेट की घटनाओं के साथ सटीक हो गया है, तो हम पौधों को बीज के चरण में बढ़ने की अनुमति भी देंगे। बाकी को छोड़ दिया जाता है। इसलिए जो भी पौधे हम बीज चरण तक उगाते हैं, वह हमेशा सही जीन संपादन ले जाएगा। (OSWRKY6), “डॉ। गिरी कहते हैं।
विदेशी डीएनए
तीसरी बड़ी आपत्ति विदेशी डीएनए की उपस्थिति है। CRISPR जीन संपादन में उपयोग किया जाने वाला CAS9 प्रोटीन से व्युत्पन्न है स्ट्रेप्टोकोकस पाइजोजेन बैक्टीरिया। इसलिए, CAS9, जो डीएनए-कटिंग एंजाइम के रूप में कार्य करता है, विदेशी डीएनए को वहन करता है। विदेशी डीएनए भी मिट्टी के जीवाणु से आता है जिसका उपयोग पौधों की कोशिकाओं में CRISPR-CAS9 घटकों को वितरित करने के लिए एक वेक्टर के रूप में किया जाता है।
डॉ। गिरी का दावा है कि बैक्टीरिया से डीएनए को दूसरी पीढ़ी में एक साधारण मेंडेलियन अलगाव विधि के माध्यम से हटा दिया जाता है, क्योंकि पौधों को बीज चरण में बढ़ने से पहले परीक्षण किया जाता है कि क्या जीन संपादन किसी भी ऑफ-टारगेट घटनाओं के बिना सटीक हो गया है। “यदि आपके पास एक विशेषता है, तो अगली पीढ़ी 3: 1 में अलग हो जाएगी, जहां तीन में विदेशी डीएनए होगा, और एक नहीं होगा। अगली पीढ़ी में, विदेशी डीएनए मुक्त पौधों की पहचान और प्रचारित किया जाता है,” वे कहते हैं।
“डीएनए को निकालना संभव है एग्रोबैक्टीरियम टूमफासीन्स -मिट्टी के जीवाणु का उपयोग पौधों की कोशिकाओं में CRISPR-Cas9 घटकों को वितरित करने के लिए एक वेक्टर के रूप में किया जाता है-मेंडेलियन अलगाव विधि के माध्यम से, “डॉ। शिवप्रासाद की पुष्टि करता है। जब मिट्टी जीवाणु वेक्टर को हटा दिया जाता है, एस पायोजेन्स जीवाणु भी स्वचालित रूप से हटा दिया जाता है।
भारत लगभग पूरी तरह से आयात पर निर्भर है – लगभग 4.5 मिलियन टन डायमोनियम फॉस्फेट (डीएपी) – फॉस्फेट उर्वरकों की मांग को पूरा करने के लिए। जीन-संपादित तकनीक, यदि भारतीय चावल की किस्मों में सफलतापूर्वक दोहराई जाती है, तो संभवतः स्थायी कृषि की दिशा में योगदान कर सकती है।
